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doc#165121 | con l' annealing in quanto se hai avuto risultati positivi con altri campioni vuol dire che in quei casi l' annealing � avvenuto in modo efficiente a quella temperatura. . [ |
doc#165121 | tutti , sono nuova e volevo complimentarmi per il bellissimo sito e per l' idea che ci sta dietro . Vi scrivo in realt� per porvi un problema ( magari qualcuno |
doc#165121 | qualcuno di voi riesce ad illuminarmi ) : ho un protocollo di PCR gi� collaudato che uso ormai di routine per amplificare DNA di alcuni pesci . Recentemente non riesco pi� |
doc#165121 | non riesco pi� ad ottenere nessun prodotto di amplificazione , nemmeno se carico campioni vecchi che mi venivano in passato , tutti tranne 1 che continua a venire nessuno sa perch� |
doc#165121 | , nemmeno se carico campioni vecchi che mi venivano in passato , tutti tranne 1 che continua a venire nessuno sa perch� ... Preciso che ho gi� controllato i protocolli e |
doc#165121 | in passato , tutti tranne 1 che continua a venire nessuno sa perch� ... Preciso che ho gi� controllato i protocolli e che i pesci sono della stessa specie . Non |
doc#165121 | continua a venire nessuno sa perch� ... Preciso che ho gi� controllato i protocolli e che i pesci sono della stessa specie . Non dovrebbero esserci pertanto mutazioni in grado di |
doc#165121 | grado di interferire con la reazione , o comunque non ci dovrebbero essere con campioni che avevo gi� analizzato e mi venivano bene in passato . Ho gi� provato a cambiare |
doc#165121 | i reagenti ( DNTPs , primers , Buffer , Taq e anche il campione ( che potrebbe essersi degradato nel tempo o essere sporco , ma nulla ) . Recentemente ho |
doc#165121 | o essere sporco , ma nulla ) . Recentemente ho riordinato i primers per escludere che per qualche motivo si fossero degradati , ma non cambia niente . La cosa buffa |
doc#165121 | qualche motivo si fossero degradati , ma non cambia niente . La cosa buffa � che un' altra PCR di amplificazione , sugli stessi campioni , produce ottimi ampliconi e quindi |
doc#165121 | altra PCR di amplificazione , sugli stessi campioni , produce ottimi ampliconi e quindi dubito che si tratti del DNA o del thermal cycler . Il prodotto di PCR che ottengo |
doc#165121 | dubito che si tratti del DNA o del thermal cycler . Il prodotto di PCR che ottengo con questa reazione che non mi viene ssomiglia ad un DNA degradato . Qualcuno |
doc#165121 | DNA o del thermal cycler . Il prodotto di PCR che ottengo con questa reazione che non mi viene ssomiglia ad un DNA degradato . Qualcuno x caso ha idee/suggerimenti in |
doc#165121 | ha risposto prima . Ho avuto lo stesso problema e ho risolto dopo mesi scoprendo che era un problema della lid della PCR che non manteneva la temperatura costante . Quindi |
doc#165121 | problema e ho risolto dopo mesi scoprendo che era un problema della lid della PCR che non manteneva la temperatura costante . Quindi a volte la PCR veniva altre no. Appena |
doc#165121 | tutti , sono nuova e volevo complimentarmi per il bellissimo sito e per l' idea che ci sta dietro . Vi scrivo in realt� per porvi un problema ( magari qualcuno |
doc#165121 | qualcuno di voi riesce ad illuminarmi ) : ho un protocollo di PCR gi� collaudato che uso ormai di routine per amplificare DNA di alcuni pesci . Recentemente non riesco pi� |
doc#165121 | non riesco pi� ad ottenere nessun prodotto di amplificazione , nemmeno se carico campioni vecchi che mi venivano in passato , tutti tranne 1 che continua a venire nessuno sa perch� |
doc#165121 | , nemmeno se carico campioni vecchi che mi venivano in passato , tutti tranne 1 che continua a venire nessuno sa perch� ... Preciso che ho gi� controllato i protocolli e |
doc#165121 | in passato , tutti tranne 1 che continua a venire nessuno sa perch� ... Preciso che ho gi� controllato i protocolli e che i pesci sono della stessa specie . Non |
doc#165121 | continua a venire nessuno sa perch� ... Preciso che ho gi� controllato i protocolli e che i pesci sono della stessa specie . Non dovrebbero esserci pertanto mutazioni in grado di |
doc#165121 | grado di interferire con la reazione , o comunque non ci dovrebbero essere con campioni che avevo gi� analizzato e mi venivano bene in passato . Ho gi� provato a cambiare |
doc#165121 | i reagenti ( DNTPs , primers , Buffer , Taq e anche il campione ( che potrebbe essersi degradato nel tempo o essere sporco , ma nulla ) . Recentemente ho |
doc#165121 | o essere sporco , ma nulla ) . Recentemente ho riordinato i primers per escludere che per qualche motivo si fossero degradati , ma non cambia niente . La cosa buffa |
doc#165121 | qualche motivo si fossero degradati , ma non cambia niente . La cosa buffa � che un' altra PCR di amplificazione , sugli stessi campioni , produce ottimi ampliconi e quindi |
doc#165121 | altra PCR di amplificazione , sugli stessi campioni , produce ottimi ampliconi e quindi dubito che si tratti del DNA o del thermal cycler . Il prodotto di PCR che ottengo |
doc#165121 | dubito che si tratti del DNA o del thermal cycler . Il prodotto di PCR che ottengo con questa reazione che non mi viene ssomiglia ad un DNA degradato . Qualcuno |
doc#165121 | DNA o del thermal cycler . Il prodotto di PCR che ottengo con questa reazione che non mi viene ssomiglia ad un DNA degradato . Qualcuno x caso ha idee/suggerimenti in |
doc#165121 | essere molti . per prima cosa � importante sapere se in passato hai testato campioni che avevi dosato allo spettrofotometro . Alcune volte la PCR non viene perch� l' estrazione dei |
doc#165121 | gi� conosciuti , porta ad una resa in temrmini di DNA differente . Questo causa che alcune volte la concentrazione del DNA � corretta , nel senso che non � n� |
doc#165121 | . Questo causa che alcune volte la concentrazione del DNA � corretta , nel senso che non � n� troppo grande n� troppo piccola . Infatti in entrambe queste circostanze non |
doc#165121 | n� troppo piccola . Infatti in entrambe queste circostanze non otterrai nessun amplificato . Ricorda che in biologia moecolare e con il DNA in particolare � pi� facile amplificare con basse |
doc#165121 | con il DNA in particolare � pi� facile amplificare con basse concentrazioni di templato piuttosto che con alte concentrazioni . Quindi ti conviene estrarre di nuovo il campione , se ancora |
doc#165121 | disposizione e se non puoi dosarlo fai diluizioni 1:10 sequenziali . La seconda possibilit� � che hai un inibitore nel tuo campione od anche nell' ambiente di estrazione che causa l' |
doc#165121 | possibilit� � che hai un inibitore nel tuo campione od anche nell' ambiente di estrazione che causa l' alternanza di rusultati positivi e negativi , cio� qualche volta la PCR viene |
doc#165121 | a capire perch� pi� aumenta la diluizione del campione pi� aumenta la diluizione dell' inibitore che quindi agisce meno . Altra possibilit� � quella di fare un gradiente termico sullo stesso |
doc#165121 | termico sullo stesso campione . In pratica imposta il termociclatore , se ne hai uno che ti permette di farlo , in modo tale che ogni fila di pozzetti lavori a |
doc#165121 | termociclatore , se ne hai uno che ti permette di farlo , in modo tale che ogni fila di pozzetti lavori a temperature crescenti o descrescenti , come preferisci , facendo |
doc#165121 | di pozzetti lavori a temperature crescenti o descrescenti , come preferisci , facendo in modo che le temperature si differenzino di pochi gradi centigradi , per esmpio , 52�c,54�c,56�c 58�c ect |
doc#165121 | per esmpio , 52�c,54�c,56�c 58�c ect . Pi� � bassa la temperatura pi� � possibile che i primer sileghino , in modo apsecifico , ma si legheranno . Anche in questo |
doc#165121 | tutti , sono nuova e volevo complimentarmi per il bellissimo sito e per l' idea che ci sta dietro . Vi scrivo in realt� per porvi un problema ( magari qualcuno |
doc#165121 | qualcuno di voi riesce ad illuminarmi ) : ho un protocollo di PCR gi� collaudato che uso ormai di routine per amplificare DNA di alcuni pesci . Recentemente non riesco pi� |
doc#165121 | non riesco pi� ad ottenere nessun prodotto di amplificazione , nemmeno se carico campioni vecchi che mi venivano in passato , tutti tranne 1 che continua a venire nessuno sa perch� |
doc#165121 | , nemmeno se carico campioni vecchi che mi venivano in passato , tutti tranne 1 che continua a venire nessuno sa perch� ... Preciso che ho gi� controllato i protocolli e |
doc#165121 | in passato , tutti tranne 1 che continua a venire nessuno sa perch� ... Preciso che ho gi� controllato i protocolli e che i pesci sono della stessa specie . Non |
doc#165121 | continua a venire nessuno sa perch� ... Preciso che ho gi� controllato i protocolli e che i pesci sono della stessa specie . Non dovrebbero esserci pertanto mutazioni in grado di |
doc#165121 | grado di interferire con la reazione , o comunque non ci dovrebbero essere con campioni che avevo gi� analizzato e mi venivano bene in passato . Ho gi� provato a cambiare |
doc#165121 | i reagenti ( DNTPs , primers , Buffer , Taq e anche il campione ( che potrebbe essersi degradato nel tempo o essere sporco , ma nulla ) . Recentemente ho |
doc#165121 | o essere sporco , ma nulla ) . Recentemente ho riordinato i primers per escludere che per qualche motivo si fossero degradati , ma non cambia niente . La cosa buffa |